La resistencia antifúngica está aumentando progresivamente. Las razones son múltiples e incluyen:
- Emergencia de nuevas especies resistentes como Candida auris y Trichphyton indotineae
- Reemplazo de especies sensibles por especies resistentes en pacientes bajo profilaxis o tratamiento antifúngico (tal es el caso de Candida glabrata bajo tratamiento con fluconazol)
- Emergencia de resistencia bajo tratamiento (por ejemplo, Aspergillus fumigatus en tratamiento con itraconazol o voriconazol o Cryptococcus neoformans en tratamiento con fluconazol)
- Emergencia de resistencia a azoles en Aspergillus a raíz del uso de azoles fungicidas en la agricultura.
Algunas especies de hongos son intrínsecamente resistentes a ciertos antifúngicos, a veces múltiples. Los ejemplos más comunes son Candida krusei a fluconazol, Aspergillus terreus a anfotericina B, Aspergillus calidoustus a azoles, Fusarium spp. a fluconazol y Mucorales a voriconazol. En estos casos, la identificación de la especie es suficiente y es innecesario realizar tests de susceptibilidad a los antifúngicos cuyo perfil de resistencia ya se conoce (aunque a veces se realiza como parte de un panel de varios antifúngicos).
La amplia mayoría de los tests de susceptiblidad antifúngica se realizan sobre cultivos positivos. En años recientes se ha introducido la detección molecular directa (por PCR) de algunos marcadores de resistencia.
Tests de susceptibilidad basados en cultivo
- Sistemas de referencia para la determinación de la susceptibilidad antifúngica
Esfuerzos académicos en los Estados Unidos (NCCLS, actualmente CLSI) y en Europa (EUCAST) desde mediados de los años 90’ condujeron a la definición de métodos para identificar resistencia antifúngica, inicialmente en especies comunes de Candida a fluconazol y de Aspergillus spp. a itraconazol. Estos métodos evolucionaron a lo largo de muchos años para incluir antifúngicos y hongos adicionales.
El comité de EUCAST AFST provee de exhaustivos métodos de referencia para la determinación de susceptibilidad de Candida spp., Cryptococcus spp., Aspergillus spp. y, más recientemente, de dermatofitos. El método consiste en la utilización de microplacas con medio RPMI con glucosa y requiere de una preparación cuidadosa del inóculo y de precaución en la lectura del punto de corte. Las CIMs de levaduras y de dermatofitos se leen con espectrofotómetro, las de Aspergillus spp. al ojo desnudo. Los métodos detallados se encuentran en el siguiente link: https://www.eucast.org/astoffungi/methodsinantifungalsusceptibilitytesting y las guías para interpretación y reporte en: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Clinical_breakpoints/AFST_BP_v10.0_200204_updatd_links_200924.pdf
El Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI por su sigla en inglés) provee de métodos de microtitulación alternativos para la determinación de susceptibilidad de Candida spp., otras levaduras y hongos filamentosos, incluyendo Aspergillus spp. Este método utiliza microplacas de fondo curvo y lectura visual. Una versión previa y completa de la metodología se encuentra en:
https://clsi.org/media/1461/m27a3_sample.pdf
y una versión actualizada de 2022 en: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m27m44s/
Una versión anterior del método para hongos filamentosos en: https://clsi.org/media/3682/m61ed2_sample.pdf y la actualización para 2022 en: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m38m51s/
La guía de interpretación basada en puntos de corte epidemiológicos se encuentra en el enlace:
https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m57s/
Estos sistemas han sido usados para definir los puntos de corte de resistencia, siempre que fuera posible basándose en información correlativa de resultados terapéuticos. En caso contrario, debido a información limitada, el enfoque alternativo para definir resistencia se basa en valores de corte epidemiológicos (VCE) (es decir, valores atípicos). Casi todos los puntos de corte describen inhibición; ensayos previos también describían concentraciones fungicidas, pero estas son mucho menos usadas en la práctica clínica.
- Sistemas comerciales para la determinación de susceptibilidad antifúngica
Varios sistemas comerciales se encuentran disponibles como parte de soluciones completas para los laboratorios, incluyendo discos para ensayos de disco-difusión y placas de microtitulación pre-llenadas para tests de microdilución en caldo. Algunos sistemas completos incluyen E-test® y varios sistemas de microtitulación, algunos de ellos con reactivos que cambian de color para ayudar a la lectura del punto final. Otros sistemas integran la identificación de levaduras con el estudio de susceptibilidad.
Tiras de difusión en agar por gradiente de antimicrobiano (elipsograma):
bioMérieux https://www.biomerieux-diagnostics.com/etestr
Lilofilchem https://www.liofilchem.com/solutions/clinical/arm/mts-mic-test-strip
Vitek 2 (bioMérieux) https://www.biomerieux-diagnostics.com/vitekr-2-0
Placas de Sensititre (microdilución en caldo): https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/YO9
Placas de microtitulación pre-elaboradas:Susceptibility testing (AST) – MERLIN Diagnostika GmbH (merlin-diagnostika.de)
Candida y otras levaduras ascomicetos
Los aislamientos de Candida spp. de hemocultivos u otros tejidos profundos (normalmente estériles) deben ser sometidos a tests de susceptibilidad antifúngica ya que la resistencia adquirida a los azoles y equinocandinas es un problema creciente. Los procedimientos estándar siguen los protocolos de microdilución en caldo de CLSI o EUCAST. Kits comerciales de microdiluación en caldo (Sensititre YeastOne®) o de tiras con gradiente de antimicrobianos por difusión en agar (comunmente conocidos como E-tests) son alternativas aceptables. La espectrometría de masas también puede proveer de resultados de susceptibilidad y uno de esos sistemas es Vitek MS®. Los puntos de corte clínicos para definir susceptibilidad o resistencia han sido evaluados por EUCAST y CLSI para las especies patógenas más relevantes de Candida. Entre las especies normalmente sensibles (por ej.: C.albicans), la resistencia a fluconazol se observa con frecuencia variable dependiendo del contexto epidemiológico (solamente 2-5% en EEUU y Europa). C.glabrata se considera habitualmente como “susceptible, dosis dependiente” y exhibe susceptibilidad variable a los azoles. C.krusei es intrínsecamente resistente a fluconazol pero no a voriconazol. No hay puntos de corte clínicos para C.auris pero el Centro para Control y Prevención de Enfermedades (CDC) ha propuesto puntos de corte tentativos (disponible en: https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-antifungal.html). Más del 90% de los aislamientos de C.auris han adquirido resistencia fluconazol. La resistencia a equinocandinas es poco frecuente (<5%) pero se encuentra en aumento y preocupa la frecuente asociación de resistencia a los azoles con la emergencia de aislamientos multi-resistentes para los cuales las opciones terapéuticas son limitadas.
Enlaces: https://www.cdc.gov/fungal/lab-professionals/pdf/afst-yeasts-h.pdf
https://www.biomerieux-usa.com/clinical/etest
Mohos formadores de conidias (hongos filamentosos)
Se recomienda la determinación de susceptibilidad antibiótica para Aspergillus spp. (en particular A.fumigatus) cuando se aisla de muestras clínicas relevantes debido a la emergencia de resistencia adquirida a los azoles. Se deben utilizar los protocolos de microdilución en caldo de CLSI o EUCAST. Los kits comerciales de microdilución en caldo (Sensititre YeastOne®) son una alternativa aceptable. Se pueden utilizar E-tests pero pueden dar valores significativamente más bajos para posaconazol. EUCAST ha propuesto puntos de corte clínicos para algunas combinaciones de especies de Aspergillus y antifúngicos (azoles, anfotericina B), pero CLSI no lo ha hecho.
Los tests de susceptibilidad antifúngica no se recomiendan de rutina para mohos patógenos diferentes de Aspergillus spp. (por ej.: Mucorales, Fusarium, Scedosporium) debido a la falta de correlación entre las CIMs y la evolución clínica y a la ausencia de puntos de corte clínicos para interpretarlos. Sin embargo, pueden ser realizados en casos individuales a fin de apoyar decisiones terapéuticas.
Cryptococcus spp.
Varios centros realizan tests de susceptibilidad para Cryptococcus spp. Mientras que algunos aislamientos son resistentes y se observan CIMs en aumento bajo tratamiento en algunos pacientes, los puntos de corte para resistencia y la correlación entre la CIM y la evolución clínica o la determinada en modelos terapéuticos experimentales es pobre. Los tests de difusión por tiras con gradiente de antimicrobiano no son adecuados para Cryptococcus neoformans.
Dermatofitos
Identificación molecular de marcadores de Resistencia
En algunos hongos existen unos pocos marcadores dominantes de resistencia, lo que permite la detección directa de resistencia aún cuando los cultivos sean negativos. Hay algunos desafíos para este atractivo concepto. En primer lugar, algunos hongos resistentes presentan varios mecanismos de resistencia, con frecuencia simultáneos, por lo que la detección molecular de marcadores de resistencia permite determinar definitivamente la resistencia pero un resultado negativo no permite excluirla. En segundo lugar, la mayoría de los blancos intra-celulares de los antifúngicos están codificados por genes de copia única, mientras que la identificación se basa generalmente en genes multi-copia (para aumentar la sensibilidad). Las señales débiles de PCR en la identificación pueden traducirse en ensayos de resistencia falsamente negativos.
Aspergillus fumigatus
La resistencia a los azoles en Aspergillus fumigatus resulta típicamente de mutaciones de puntos críticos en el gen blanco de los azoles cyp51A. Las más frecuentes de entre ellas consisten en una repetición en tandem en el promotor y uno o más puntos de mutación en el gen (TR34/L98H and TR46/Y121F/T289A). Algunos kits comerciales de PCR pueden detectar directamente estas mutaciones en muestras clínicas:
https://www.pathonostics.com/product/aspergenius
Trichophyton spp.
La resistencia a la terbinafina está emergiendo rápidamente, sobre todo en la nueva especies T. indotineae. Las mutaciones del gen de escualeno epoxidasa que más comunmente confieren resistencia pueden ser detectadas directamente por PCR. Varios productos comerciales se encuentran disponibles:
https://www.pathonostics.com/product/dermagenius
https://bakodx.com/services/terbinafine-resistance-pcr-test/#aawp_nl
Pneumocystis jirovecii
Dos mutaciones en genes de enzimas involucradas en el metabolismo del folato tienen como consecuencia la resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol y pueden ser detectadas por el ensayo comercial PneumoGenius assay: https://www.pathonostics.com/product/pneumogenius