Micología molecular - Life Worldwide ES

Es crucial identificar un patógeno fúngico y su sensibilidad a las drogas antifúngicas lo más pronto posible para que el tratamiento pueda ser iniciado a la brevedad. Sin embargo, las estrategias basados en cultivo son lentas y de baja sensibilidad, requiriendo a veces días (o incluso semanas). Esto ha llevado al desarrollo de modernas estrategias moleculares.

Detección directa de ácido nucleico del patógeno fúngico para diagnóstico
Identificación de cultivos positivos a nivel de género o especie
Tipificación molecular y filogenética para análisis de brotes y clusters
Identificación rápida de mecanismos de resistencia antifúngica
Detección rápida por qPCR de una amplia gama de Coccidioides en muestras clínicas: ¿se acabó la era del cultivo?

FACTORES QUE AFECTAN SU DESEMPEÑO: El tipo de muestra, la preparación de la muestra y las condiciones de laboratorio cuidadosamente controladas son esenciales para obtener resultados óptimos y para evitar resultados falsos positivos y falsos negativos. El desempeño de la prueba y los valores de corte varían según los diferentes grupos de pacientes y los tipos de muestra. La validación clínica representa un desafío y requiere de tiempo ya que deben realizarse pruebas en muestras de diferente tipo y de diferentes grupos de pacientes, y los métodos actuales para confirmar el diagnóstico son poco precisos. Algunas drogas y otras sustancias pueden inhibir las reacciones de PCR, por lo que todos los ensayos diagnósticos deben incluir un control de amplificación para excluir una falla de la reacción (falso negativo) debido a inhibición. Esta práctica es estándar para las pruebas comerciales pero no para algunos de los ensayos in house. También es importante incluir controles negativos para descartar contaminación, tanto ambiental como por amplicones (es decir, por arrastre de una PCR previa), lo que llevaría a resultados falsos positivos.

DISPONIBILIDAD: Algunas pruebas se encuentran disponibles comercialmente y están validadas parcial o completamente. Algunas se ofrecen en el mercado y generalmente fueron validadas analíticamente pero no siempre clínicamente.

Selecting a specimen

PCR

CÓMO FUNCIONA: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) se usa para amplificar regiones cortas de ADN usando cebadores (o primers) específicos para el gen en particular que se quiere investigar y, a veces, para una especie particular. La medición de la velocidad de amplificación en tiempo real (qPCR o PCR en tiempo real) es un importante método diagnóstico.

Pneumocystis jirovecii

P. jirovecii no puede ser cultivado in vitro. Su detección molecular es sustancialmente más sensible que las tinciones de rutina y algo más sensibles que la inmunofluorescencia.

BLANCOS: Varias regiones de ADN que son únicas de P. jirovecii se han usado como blancos para la amplificación de ADN, en particular la subunidad grande del ribosoma mitocondrial (mtLSU rARN) y genes de la familia de la glicoproteína mayor de superficie. Otros blancos incluyen: la región de ARNr 5S; dihidropteroato sintasa (DHPS); dehidrofolato reductasa (DHFR); espaciador transcrito interno ADNr (ITS); proteína de shock térmico 70 (HSP70); serin endoproteasa que codifica para Kex-1.

DESEMPEÑO: En 1990 se demostró por primera vez que la mt LSU rARN es un excelente blanco molecular para el diagnóstico rápido y sensible de PCP (neumonía por P. jirovecii) en muestras de lavado broncoalveolar (LBA) y de expectoración, que actualmente tiene una sensibilidad de 90 a 100%. La PCR cuantitativa en tiempo real redujo el tiempo de detección a tres horas, comparable a las técnicas convencionales. La cuantificación puede ser importante para distinguir entre portadores asintomáticos y pacientes con PCP clínicamente relevante (véase más abajo). Debido a su alta sensibilidad y especificidad, el Laboratorio de Identificación de Parásitos de Interés para la Salud Pública del Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) ha clasificado a la tecnología molecular como el patrón de oro (“gold standard”) para el diagnóstico de PCP (Center for Global Health, 2009).

PROVEEDORES: Entre las pruebas comercialmente disponibles se incluyen: PCR multiplex en tiempo real para detección de mtLSU y DHPS (Pathonostics); PCR en tiempo real Pneumocystis jirovecii (Bio-Evolution); kits de PCR en tiempo real Pneumocystis carinii/jirovecii (Shanghai ZJ Bio-Tech, BioProducts AT, Clongen or Vacunek); kit Pneumocystis jirovecii (carinii) FRT PCR (AmpliSens); RIDA-GENE Pneumocystis jirovecii (R-Biopharm AG); Pneumocystis jirovecii FTD (Fast-Track Diagnostics); kit Progenie (Progenie Molecular); reactivos para el sistema BD MAX^® Pneumocystis jirovecii (BioGX). También se dispone de kits no aprobados como LightMix Kit Pneumocystis jirovecii (TIB MOLBIOL); MycoReal Pneumocystis (Ingenetix GmBH) y PCR en tiempo real Pneumocystis jirovecii (PrimerDesign Genesig). El kit de Bio-evolution parece tener una sensibilidad sustancialmente menor al kit de AmpliSens.

TIPOS DE MUESTRA: P. jirovecii puede detectarse en varios tipos de muestras respiratorias, incluyendo LBA, aspirado bronquial, aspirado endotraqueal, expectoración y esputo inducido. El lavado oral puede ser una alternativa útil pero la señal de PCR se degrada rápidamente a menos que se transporte en hielo hasta su procesamiento. Hay reportes ocasionales de detección de P. jirovecii en sangre y otras muestras como humor vítreo y tejidos.

Aspergillus

Aunque Aspergillus spp. puede cultivarse a veces a partir de secreciones respiratorias de pacientes con aspergilosis invasiva, crónica y alérgica, el rendimiento es bajo, y aún más bajo a partir de sangre (<1%). El diagnóstico molecular es más sensible y potencialmente más rápido; la secuenciación subsiguiente de muestras positivas puede proveer información de especie, que no se puede obtener con otros marcadores tales el galactomanano y el 1,3-beta-D-glucanO.

DESEMPEÑO: El principal desafío para alcanzar una sensibilidad aceptable para la detección de Aspergillus (y otros hongos filamentosos) es obtener una muestra de buena calidad, un sistema de extracción de ADN eficiente y una PCR en tiempo real de alta sensibilidad. La principal dificultad para conseguir un sistema totalmente operativo y útil en el laboratorio de microbiología clínica es evitar los resultados falsos positivos debido a la contaminación con ADN ambiental de Aspergillus en el recipiente de la muestra o en el reactivo de extracción.

BLANCOS: Las regiones de detección más comunes son 18S rARN, 28S ARNr y regiones ITS. Todos son genes multicopia con 35-90 copias por genoma nuclear. Estos blancos ofrecen una amplificación natural, mejorando la sensibilidad de la detección. Sin embargo, algunos primers y sondas excluyen algunas especies comunes de Aspergillus, o solamente incluyen A. fumigatus. Muchos sistemas no pueden distinguir al género estrechamente relacionado Penicillium spp, lo que afecta levemente la especificidad.

PROVEEDORES: Las pruebas disponibles comercialmente incluyen (2012): MycAssay Aspergillus (Microgen Bioproducts Ltd), Septifast (Roche), VetPCR ASP.FUM (BioinGentech), MycoReal Aspergillus (Ingenetix GmbH), RenDx multiplex Aspergillus spp & Candida spp (sangre entera, plasma y suero), AsperGenius (Pathonostics), Mycogenie (Ademtech), and Goldstream (Era Biology). En una comparación directa, MycAssay Aspergillus fue superior a Aspergillus spp. Q-PCR Alert. Se carece de otras comparaciones. Algunos kits están diseñados únicamente para sangre, otros para muestras respiratorias o de otro origen. Esto se debe principalmente a diferencias en la extracción de ADN fúngico de la muestra, necesaria para la validación clínica.

ESTANDARES: Se dispone de una PCR estándar internacional para el desarrollo interno de ensayos moleculares para Aspergillus spp (Lyon et al. 2013)

A PARTIR DE SANGRE: En la sangre (y existen muchas formas de extracción de ADN a partir de sangre entera, coágulos, suero, plasma) en pacientes hematológicos, meta-análisis de PCR en tiempo real sugieren una sensibilidad aproximada de 75% y un valor predictivo negativo (VPN) superior a 95%. La sensibilidad es mucho menor en pacientes no hematológicos. Estas características de desempeño tienen buena correlación con el galactomanano. Una área de incertidumbre es el desempeño relativo con y sin profilaxis antifúngica; algunas infecciones pueden diagnosticarse por PCR a pesar de la profilaxis y tratamiento empírico con itraconazol. Más aún, la aplicación de PCR luego del tratamiento para evaluar la carga de enfermedad es incierta.

A PARTIR DE MUESTRAS RESPIRATORIAS: La PCR es más sensible que el cultivo en el contexto de múltiples tipos de enfermedades. El origen de la muestra es importante. Los LBA muy diluidos tienen cargas fúngicas menores que las muestras de las vías aéreas supriores y las expectoraciones. Las muestras de pacientes con fibrosis quística requieren licuefacción para optimizar el rendimiento, ya que las muestras respiratorias son muy viscosas y contienen una compleja mezcla de ácidos nucleicos del huésped y de las bacterias.

A PARTIR DE TEJIDO: La extracción a partir de tejido fresco es más fácil que a partir de tejido fijado, pero ambas tienen un rendimiento satisfactorio para el análisis de ácidos nucleicos. Probablemente otras muestras también sean útiles, tales como raspados corneales y vitrectomía, pero la experiencia publicada es limitada. Dada la baja sensibilidad del cultivo, es probable que la PCR se convierta en la práctica estándar para este tipo especial de muestras.

Candida

Debido a que los cultivos tienen una sensibilidad aproximada de solamente 38% para la detección de candidiasis invasiva y diseminada, y a que la incubación lleva alrededor de 2 días, ha habido gran interés en la detección molecular de Candida por PCR u otros métodos moleculares.

DESEMPEÑO: Más de 4500 pacientes se han incluido en más de 50 estudios de detección de Candida spp por PCR en sangre. Es de destacar que, dado los diferentes volúmenes de sangre, métodos de extracción, diseños de PCR y determinaciones del punto finas, la sensibilidad y especificidad para detección de candidemia usando sangre entera fue del 100% en un estudio (Avni et al, 2011). Para la candidiasis invasiva a nivel de tejidos, las tasas de positividad de PCR fueron de 85%, comparado con 38% para hemocultivos. Debido a que la PCR para Candida puede realizarse en horas, esta información apoya la aplicación de rutina de PCR para detección de Candida a pacientes en riesgo de candidiasis.

PROVEEDORES: Se dispone de varios sistemas comerciales para detección de Candida spp en sangre. Fungiplex es un ensayo de PCR multiplex en tiempo real que detecta rápidamente las especies más frecuentemente asociadas a candidiasis invasiva. IMMY ofrece 2 pruebas de PCR para Candida: CandidaID y AurisID. El sistema T2Candida es un ensayo de detección triple para C. albicans y C. tropicalis juntos (límite de detección 1-2 UFC/ml), complejo C. parapsilosis (límite de detección 3 UFC/ml), y C. glabrata y C. krusei (límite de detección 1-2 UFC/ml). Se publicó un desempeño de 99% de sensibilidad y 94% de especificidad. Un sistema de PCR triplex diferente fue desarrollado por Tianjin Era Biology para la detección combinada de Candida spp., Cryptococcus spp. y Aspergillus spp. TruPCR tiene un panel de UTI que detecta Candida. Dynamiker Biotek también tiene un ensayo para identificar Candida.

BioGx tiene un kit de PCR para detección de Candida auris.

Dermatofitos y hongos cutáneos

La microscopía y el cultivo de muestras de uña, piel y cabello son métodos laboriosos y lentos que se utilizan habitualmente para establecer el diagnóstico de infección por dermatofitos. El diagnóstico molecular utilizando kits para dermatofitos y Trichophyton rubrum es más rápido y tiene una sensibilidad entre 4 y 18% superior en comparación con los métodos convencionales. El tiempo entre la recepción de la muestra y la obtención de los resultados puede ser tan breve como 5 horas, pero generalmente lleva 24 horas.

El kit de Biotype (MycoDerm) con marcado CE detecta 21 dermatofitos, levaduras y hongos filamentosos a partir de muestras clínicas. Método simple de disolución de la uña.
Fast Track Diagnostics (FTD Dermatophytes) es un kit de PCR en tiempo real con marcado CE que detecta e identifica 4 especies de Trichophyton y 3 especies de Microsporum.
Pathonostics (DermaGenius 2.0) identifica las infecciones fúngicas más prevalentes en 3 horas. Se dispone de ensayos separados: Nail multiplex y Complete multiplex.

Pruebas panfúngicas

Cuando se sospecha una infección fúngica en particular, una prueba molecular directa es de utilidad (por ej. para P. jirovecii. Sin embargo, en muchas situaciones, el diagnóstico diferencial es amplio y una prueba panfúngica es más adecuada. A medida que las bases de datos de ADN (por ej., GenBank) se han ampliado, se puede examinar mejor la especificidad precisa de los cebadores y las sondas. La sensibilidad y la cinética de reacción de cualquier ensayo variarán según el hongo que se detecte y las diferencias de extracción y número de copias internas entre diferentes géneros, especies y cepas. En general, un ensayo panfúngico podría tener utilidad si tiene un VPN alto para excluir una infección fúngica, o como un ensayo de “captura” en el que el hongo responsable preciso pueda identificarse mediante secuenciación en un segundo paso. Un problema muy específico de los ensayos panfúngicos es la contaminación de todos los reactivos del ensayo y de todo el material plástico. La frecuencia de falsos positivos es problemática.

PROVEEDORES: Solamente se dispone de un ensayo panfúngico (2012), el kit MycoReal Fungi (Panfungal PCR; Ingenetix GmbH, Vienna). No existen publicaciones sobre esta prueba.

Identificación de los cultivos

A veces un hongo puede verse al microscopio pero no puede cultivarse. Es importante identificar al hongo en cuestión a nivel de género y, de preferencia, de especie. Cuando se usan tejidos frescos, no incluidos en parafina, la sensibilidad de la PCR para detección de hongos excede el 95%, mientras que la sensibilidad en tejidos en parafina es de aproximadamente 60%. Si se sospecha fuertemente una infección fúngica antes de la biopsia o resección, conservar parte de la muestra fresca (es decir, no colocada en formalina) puede facilitar el diagnóstico etiológico. El ADN extraído de muestras FFPE puede degradarse y encontrarse en bajas concentraciones y, con frecuencia, contiene sustancias que inhiben la digestión de proteínas o la amplificación del ADN. Sin embargo, cuando se detectan elementos fúngicos en secciones de tejido FFPE y no se dispone de cultivo de hongos, la PCR puede en algunos casos determinar el organismo que está causando la infección.

BLANCOS: Una estrategia común es amplificar una o dos regiones discriminatorias (como ITS1 y D1-2 de 28S) y secuenciarlas. Para algunas especies, otros genes de copia única parecen ser más discriminatorios para determinar la especie, como la calmodulina, pero este enfoque se ha aplicado raramente a muestras de tejido o positivas por microscopía.

PROVEEDORES: Incluyen MicroSeq D2 LSU rDNA Fungal Identification Kit (Applied Biosystems), BlackLight® Fungal ID Kit (BlackBio), Pyrosequencing (Qiagen), AccuProbe kits para la identificación de Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum and Coccidioides immitis. La metodología PNA FISH (AdvanDx) es un indicador parcial de la presencia de especies de Candida en hemocultivos.

Solamente para Aspergillus spp. se ha publicado una técnica disponible comercialmente para determinar el género de hongos encontrados en secciones de tejido, pero este método no discrimina las especies de Aspergillus. La mayoría de los ensayos publicados amplifican genes específicos de ARNr (18S o D1-2 de 28S) o al espaciador transcrito interno (ITS1 e ITS2).

BASE DE DATOS: Actualmente, uno de los mayores desafíos es la calidad relativamente baja de las bases de datos para la comparación bioinformática. Recientemente, el ISHAM ha abordado este problema y la base de datos se encuentra ahora on line. La base de datos contiene actualmente más de 3200 secuencias que representan 524 especies de hongos patógenos humanos y animales. La denominación de los organismos también está actualizada y evita el problema de la nomenclatura antigua, que es un problema importante con GenBank. Al informar la identificación, utilice siempre el nombre actualmente aceptado y el más reconocido por los médicos para que puedan vincular el hallazgo con la literatura.